Caractérisation des ADN polymérases de Pyrococcus abyssi en présence de matrices ADN endommagées
| Autre(s) titre(s) | Characterisation of the DNA polymerases from Pyrococcus abyssi in the presence of damaged DNA | ||||||||
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| Type | Thèse | ||||||||
| Date | 2009-10-08 | ||||||||
| Langue(s) | Français | ||||||||
| Auteur(s) | Palud Adeline | ||||||||
| Université | Université de Bretagne Occidentale | ||||||||
| Discipline | Biochimie/Microbiologie | ||||||||
| Directeur de thèse | Jean-Paul RAFFIN | ||||||||
| Co-directeur | HENNEKE Ghislaine | ||||||||
| Financement | IFREMER/Région Bretagne | ||||||||
| Mot-Clé(s) | PCR sur ADN endommagé, Bioréacteur gas lift, Détection de lésions, Translésion, 8 oxo dGTP, 8 oxo dA, 8 oxo dG, sites AP, Archaea, ADN polymérases | ||||||||
| Résumé | Les archaea hyperthermophiles sont inféodées à des biotopes hostiles, où sévissent des conditions extrêmes de température, de pH, de pression et des radiations ionisantes. Ces environnements sont propices à l'apparition de lésions dans l'ADN, telles que les sites apuriniques (AP) ou encore les lésions oxydatives comme la 8-oxo-dG ou la 8-oxo-dA. Dans le cadre de ce projet, l'euryarchaea hyperthermophile Pyrococcus abyssi (Pab) a été utilisée comme modèle attractif pour étudier l'impact de ces lésions sur la maintenance de l'intégrité génomique. La première partie consacrée à la détection des dommages dans le génome de Pab a permis de démontrer que : -Pab possède un taux légèrement plus élevé de sites AP et de lésions 8-oxo-dG que ceux mesurés chez Escherichia coli, en phase exponentielle. -Suite à un stress oxydatif appliqué en bioréacteur gas-lift pour la première fois, l'augmentation du taux de 8-oxo-dG observée est corrélée à une diminution importante de la survie cellulaire, soulignant l'effet génotoxique du stress chez Pab. Le second objectif a été d'élucider le comportement des deux ADN polymérases réplicatives de Pab, PabpolB (Famille B) et PabpolD (Famille D), en présence de matrices ADN endommagées. Les résultats sont les suivants : -Bien que les Pabpols réussissent à franchir les lésions 8-oxo-dG et 8-oxo-dA, elles sont sévèrement bloquées par le site AP. -Les paramètres cinétiques d'incorporation ont mis en évidence la très haute fidélité des Pabpols en présence d'ADN non endommagé. Néanmoins, elles sont sensibles à la présence de la lésion AP et favorisent majoritairement l'incorporation d'un dAMP face à ce dommage, indépendamment du contexte nucléotidique. Leur fonction exonucléasique joue alors un rôle important dans la protection contre la mutagénèse, car elle agit comme une barrière cinétique à l'incorporation illégitime en face de cette lésion. -L'incorporation du dAMP est aussi privilégiée en face de la lésion 8-oxo-dG par les deux Pabpols. En revanche, face à la lésion 8-oxo-dA, PabpolD incorpore majoritairement un dAMP et un dTMP alors que PabpolB n'insère aucun nucléotide. -Les Pabpols insèrent également le dGTP oxydé 8-oxo-dGTP, majoritairement en face d'un C. La troisième partie, focalisée sur les applications biotechnologiques des Pabpols a souligné la capacité des Pabpols à amplifier de l'ADN endommagé, par la technique de PCR. Ces enzymes pourraient à l'avenir constituer d'excellents outils pour amplifier, par exemple, de l'ADN endommagé, issu de fossiles, d'échantillons hydrothermaux ou encore d'ADN en médecine légale... |
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| Keyword(s) | PCR on damaged DNA, Gas lift bioreactor, Detection of lesions, Translesion, 8 oxo dGTP, 8 oxo dA, 8 oxo dG, AP sites, Archaea, DNA polymerases | ||||||||
| Résumé en anglais | Hyperthermophilic archaea cope with harsh conditions such as high temperatures, high pressures, pH shifts and ionising radiations. Such environments favour the apparition of DNA lesions like apurinic (AP) sites or oxidized DNA bases (8-oxo-dG and 8-oxo-dA). Here, Pyrococcus abyssi (Pab) was used as an attractive model to analyse the impact of such lesions onto the maintenance of genome integrity. The first part aimed at detecting DNA damages in the genome of Pab: -Endogenous AP sites and the oxidized DNA base 8-oxo-dG persist at a slightly higher level in Pab genome compared with Escherichia coli. -Under oxydative stress conditions performed in a gas-lift bioreactor for the first time, the 8-oxo-dG increasing rate is correlated to the important cell survival diminution, assessing the genotoxic effects of this stress on Pab. The second objective was to unravel the behaviour of the two replicative DNA polymerases from Pab, PabpolB (Family B) and PabpolD (Family D), in the presence of damaged DNA. The significant results are the following: -Both Pabpols are able to bypass 8-oxo-dG and 8-oxo-dA whereas they are strongly blocked by the AP site. -Steady-state kinetics reinforced that Pabpols are high-fidelity DNA polymerases onto undamaged DNA. Moreover, Pabpols preferentially inserted dAMP opposite an AP site independently of the nucleotidic sequence context, albeit inefficiently. Their exonuclease function seemed to endow with an important role in the protection against mutagenesis since it acts as a kinetic barrier, preventing from miscoding insertion in front of an AP site. -The preferential incorporation of the dAMP is also favoured in front of 8-oxo-dG by both Pabpols. However, PabpolD bypass 8-oxo-dA by inserting a dAMP or a dTMP opposite the lesion while PabpolB could not insert a dNTP. -Pabpols can also incorporate the oxidized dGTP, 8-oxo-dGTP, opposite template cytosine. The third part focused on biotechnological applications of the Pabpols and showed that both Pabpols are able to amplify damaged DNA by PCR. In the future, these enzymes could be used as powerful tools in order to amplify, for example, forensic or ancient DNA, DNA from hydrothermal vents or clinical specimens damaged DNA... |
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| Texte intégral |
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