| Autre(s) titre(s) |
DNA polymerases B et D from hyperthermophile Archaea, Pyrococcus abyssi : contribution to the study of structure-fonction relationships |
| Type |
Thèse |
| Date |
2009-11-06 |
| Langue(s) |
Français |
| Auteur(s) |
Castrec Benoit |
| Université |
Université européenne de Bretagne |
| Discipline |
Biochimie |
| Directeur de thèse |
Jean-Paul RAFFIN |
| Financement |
Région Bretagne |
| Mot-Clé(s) |
thermostabilité, interactions, motifs, réplication de l'ADN, RF C, PCNA, ADN polymérases, Archaea |
| Résumé |
La réplication de l'ADN est un mécanisme fonctionnellement conservé à travers les trois domaines du vivant. Le processus est effectué par des ADN polymérases, accompagnées de deux facteurs accessoires, le PCNA et le RF-C, respectivement le facteur de processivité et le facteur de chargement. Notre modèle d'étude, l'Euryarchaeota Pyrococcus abyssi, possède une ADN polymérase monomérique appartenant à la famille B, et une ADN polymérase hétérodimérique, appartenant à la famille D. En grande majorité, les protéines interagissent avec le PCNA au niveau d'une poche hydrophobe, formée par l'IDCL (interdomain connecting loop) et la partie C-terminale. Ces interactions sont médiées au travers de motifs communs, dont le motif PIP box (PCNA interacting Protein). Nous avons démontré que la Pol B a juste un motif PIP box à l'extrémité C-terminale, alors que la Pol D contient deux motifs d'interaction au PCNA, situés au niveau des extrémités N- et C-terminales. En outre, un travail de mutagenèse dirigée a été réalisé au niveau de plusieurs sites définissant la poche hydrophobe du PCNA et a permis de mettre en évidence le fait que la Pol D interagit précisément au niveau de l'extrémité C-terminale du PCNA. De la même façon, nous avons démontré que le RF-C, via son motif PIP box, maintient le PCNA sur l'ADN et peut bloquer le complexe Pol D-PCNA. Par ailleurs, un motif riche en glycines a été caractérisé chez la Pol D. Ce motif, renommé PYF box, est impliqué dans la thermostabilité de cette enzyme et pourrait participer aux interactions entre les deux sous-unités DP1 et DP2. Enfin, des travaux préliminaires en spectroscopie de fluorescence ont été menés et nous offrent de nombreuses perspectives quant à l'étude des complexes nucléoprotéiques. La recherche des motifs, impliqués dans les relations structure-fonction, nous permet de compléter nos connaissances sur les mécanismes du système réplicatif des archées et sur la Pol D, qui reste encore largement méconnue. |
| Keyword(s) |
thermostability, interactions, motifs, DNA replication, RF C, PCNA, DNA polymerases, Archaea |
| Résumé en anglais |
DNA replication is a functionally conserved mechanism among the three domains of life. This processus is performed by DNA polymerases with two accessories factors, PCNA and RF-C, sliding clamp and clamp loader, respectively. Our model of study, the Euryarchaeota Pyrococcus abyssi, possesses one monomeric DNA polymerase, belonging to the Family B, and one heterodimeric DNA polymerase, belonging to the Family D. Usually, proteins interact with PCNA at a hydrophobic pocket which is formed by the IDCL (interdomain connecting loop) and the C-terminus. These interactions are mediated through common motifs like the PIP box (motif PCNA interacting Protein). We have demonstrated that Pol B has just one PIP box motif at the C-terminus, while Pol D has two PIP-type motifs, at the N- and C terminus, respectively, that interact with PCNA. Besides, directed mutagenesis has been performed at different sites into the hydrophobic pocket of PCNA and permit to give prominence to that Pol D precisely interacts at the C terminus of PCNA. In the same way, we have demonstrated that RF-C, via its PIP box motif, can maintain PCNA on DNA and can block the Pol D/PCNA complex. In addition, a glycine-rich motif has been characterised in Pol D. This motif, renamed PYF box, is implicated in thermostability of this enzyme and could participate to the interactions between subunits DP1 and DP2. Finally, preliminary work on fluorescence spectroscopy gives us some perspectives in the study of nucleo-proteic complexes. The investigation of motifs, implied in structure-function relationship, let us to complete our knowledge about mechanisms of replicative systems in Archaea and more precisely on Pol D, which is still largely unknown. |
| Texte intégral |
| Fichier |
Pages |
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Accès |
| these-6940.pdf |
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2 MB |
Libre accès |
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