This research has been carried out in order to better understand the relationships between bacterial communities, established within the biofilter of a recirculating aquaculture system, and the influence exerted by forcing factors on the system itself. The work was divided into three main objectives that were aimed at studying: - the composition of the metabolically active bacterial fraction through the construction of cDNA clone libraries and the application of fingerprinting techniques (e.g., the T-RFLP); - the effect of particulate organic carbon on both the nitrification process and the microbial communities in different types of biological filters; - the effect of a moderate increase in the oxidation-reduction potential (ORP), through the injection of ozone, towards the activity and structure of the bacterial communities. The cDNA clone libraries allowed subdividing the active community in 48 phylotypes, each corresponding to a species. The Gammaproteobacteria (59.7%) were predominant, followed by Alphaproteobacteria (11.5%) and Bacteroidetes (7.9%). Most clones, especially among the Gammaproteobacteria, belonged to species that are potentially pathogenic to fish, even these latter were in an excellent health state during the experimentation period. This might suggest the existence of a shelter effect by the autochthonous bacterial flora against opportunistic pathogens, which are always present in such systems. Results showed a negative relationship between the nitrification efficiency and C/N ratio (defined as the ratio of particulate organic carbon and dissolved inorganic nitrogen), with a significant decrease in nitrification when the C/N ratio increased from 0 to 4. The increase of such ratio led to a dramatic increase in bacterial abundance (viable and total counts) on both the packing media and the water outlet. This suggests that the increase in organic carbon could allow to the predominance of heterotrophic bacteria on those autotrophic, which are responsible for the nitrification process, with the consequent drastic decrease in the filtration efficiency. Data regarding the effects caused by the ozonation process on water and packing media samples showed that the oxidation of organic macromolecules, by ozone, has - 4 - consequences on the whole microbial compartment. In fact, based on results from the filtration efficiency (chemical analysis on nutrients) and metabolic activity (exoenzymatic activities) determinations, the use of various methods (both molecular and chemical) confirmed that both the composition and structure of the bacterial community (as it was determined by the application of flow cytometry and clone libraries) in addition to bacterial activity, were different in untreated and ozonated biological filters. In conclusion, results provide an important contribution to the current knowledge on the dynamics and relationships between the different compartments in complex systems such as recirculated aquaculture systems, mainly giving indications about the proper management of the filters in relation to the parameters that characterize the system itself.

La presente ricerca è stata incentrata sulla comprensione delle relazioni che intercorrono tra le comunità batteriche, instaurate all’interno dei filtri biologici di un sistema di acquacoltura ricircolato, e l’influenza esercitata dalle forzanti del sistema stesso. Il lavoro è stato suddiviso in 3 obiettivi principali, volti a studiare: - la composizione della frazione batterica metabolicamente attiva tramite l’allestimento di librerie di cloni su cDNA (RNA) e l’applicazione di tecniche di fingerprinting (quali la T-RFLP); - l’effetto del carbonio organico particellato sulla nitrificazione e sulle comunità batteriche in diverse tipologie di filtri biologici; - l’effetto di un moderato aumento del potenziale di ossido-riduzione (ORP), tramite l’insufflazione d’ozono, nei confronti dell’attività e della struttura della comunità batterica. Le librerie di cloni su cDNA hanno permesso di suddividere la comunità attiva in 48 filotipi, corrispondenti ad altrettante specie. I gruppi batterici sono stati rappresentati principalmente da Gammaproteobatteri (59,7%), seguiti da Alfaproteobatteri (11,5%) e Bacteroidetes (7,9%). Molti dei cloni analizzati, soprattutto tra i Gammaproteobatteri, appartenevano a specie potenzialmente patogene per i pesci, anche se questi ultimi si trovavano in un eccellente stato sanitario durante il periodo della ricerca. Tale dato potrebbe suggerire l’esistenza di un effetto protettivo della flora batterica autoctona presente in tali impianti contro patogeni opportunisti, comunque sempre presenti in questo tipo di sistemi. I risultati emersi hanno messo in evidenza una relazione negativa tra l’efficienza di nitrificazione ed il rapporto C/N (inteso come rapporto fra Carbonio organico particellato ed Azoto inorganico disciolto), con una sensibile diminuzione della nitrificazione quando il rapporto C/N passa da 0 a 4. L’aumentare di tale rapporto ha portato ad un drastico aumento dell’abbondanza batterica (coltivabile e totale) sia sul supporto filtrante che nell’acqua in uscita dai filtri. Ciò suggerisce come l’aumento del carbonio organico porti alla predominanza di batteri eterotrofi su quelli autotrofi, responsabili della nitrificazione, con il conseguente drastico decremento dell’efficienza di filtrazione. - 2 - I dati riguardanti gli effetti causati dall’ozonizzazione su campioni d’acqua e supporto filtrante all’interno del filtro biologico hanno evidenziato come l’ossidazione delle macromolecole organiche, ad opera dell’ozono, abbia conseguenze sull’intero comparto microbico. Infatti, l’utilizzo di diverse metodiche, molecolari e chimiche, ha confermato che sia la composizione e la struttura della comunità batterica (citometria a flusso e librerie di cloni) sia la sua attività, intesa come efficienza di filtrazione (analisi chimiche sui nutrienti) e attività metabolica (attività eso-enzimatica), mostrino differenze rispetto al filtro biologico di controllo, non sottoposto ad ozonizzazione. In conclusione, i risultati ottenuti forniscono un importante contributo alle conoscenze attuali su dinamiche e relazioni che intercorrono tra i differenti comparti in sistemi complessi come gli impianti d’acquacoltura ricircolati, soprattutto per quanto concerne la corretta gestione dei filtri biologici in relazione ai parametri del sistema.