Les fèces d’animaux d’élevage et les effluents d’origine urbaine ou agricole sont les principales sources de contamination microbiologique participant à la dégradation de la qualité des eaux et des coquillages et à l’apport de pathogènes entériques dans l’environnement. La nouvelle directive européenne concernant les eaux de baignade (2006/7/CE) impose pour début 2011 la mise en place de profils de baignade avec une identification et une hiérarchisation des sources de contamination fécale des eaux. Les indicateurs classiques de contamination fécale, Escherichia coli et les entérocoques intestinaux, permettent de mettre en évidence une contamination mais pas d’en identifier l’origine. Ainsi, des méthodes alternatives, dont celles basées sur la recherche de microorganismes cibles tels que les bactéries appartenant à l’ordre des Bacteroidales ont été développées ou sont en cours de développement pour identifier l’origine humaine ou animale des contaminations. Les premiers marqueurs Bacteroidales, développés pour la PCR conventionnelle, ont généralement été très peu détectés dans les eaux de l’environnement et ils n’ont, à notre connaissance, pas été appliqués sur des coquillages. L’objectif principal de ce travail de thèse était de développer et de valider une approche moléculaire basée sur la PCR quantitative en temps réel, pour permettre l’identification de l’origine des contaminations dans les eaux et les coquillages à partir de la cible Bacteroidales. L’analyse phylogénétique des séquences de gène codant les ARNr 16S des Bacteroidales issues de fèces et d’effluents d’origine humaine, porcine, bovine et de fientes d’oiseaux sauvages a permis de développer quatre marqueurs Bacteroidales, pour identifier les contaminations fécales humaines (Hum-1-Bac), porcines (Pig-1-Bac et Pig-2-Bac) et ruminants (Rum-2-Bac). Appliqués dans des échantillons de fèces et d’effluents, ces marqueurs se sont révélés hautement sensibles (92,3 - 100 %) et spécifiques (93,4 - 100 %). L’étude de la persistance des marqueurs Pig-1-Bac et Pig-2-Bac, en microcosmes d’eau de rivière, a montré que sous les conditions les plus défavorables, saturation en oxygène dissous et température de 20°C, les marqueurs persistaient au moins 16 jours. Ces résultats suggèrent que les marqueurs Bacteroidales peuvent persister assez longtemps dans les eaux de rivière pour être identifiés. Cette hypothèse a été confirmée par leur quantification dans des eaux de rivière et des eaux estuariennes provenant du bassin versant de l’estuaire de Daoulas et de l’estuaire de l’Elorn (Finistère, Bretagne) à des concentrations comprises entre 2,7 et 6,5 U. Log10 copies/100 ml. Comparés à des marqueurs bactériens, viraux et chimiques à partir d’eaux de ruissellement et de l’environnement, les marqueurs Bacteroidales se sont avérés pertinents pour identifier l’origine des contaminations. Les marqueurs Bacteroidales spécifiques de l’hôte ont également été recherchés dans les coquillages. La sélection et l’optimisation d’un protocole d’extraction d’ADN génomique bactérien à partir des liquides intervalvaires d’huîtres artificiellement contaminées a ensuite permis de détecter et de quantifier les marqueurs dans des huîtres naturellement contaminées. La discrimination de l’origine des contaminations fécales à partir d’échantillons d’eaux et de liquides intervalvaires d’huîtres provenant des deux sites sélectionnés dans cette étude a souligné l’importance des contaminations fécales d’origine humaine et ruminant par rapport aux contaminations d’origine porcine. Cette étude, confirme ainsi l’intérêt d’utiliser des marqueurs spécifiques de l’hôte, développés à partir de la cible Bacteroidales, pour identifier l’origine des contaminations fécales au niveau des zones de baignade et des zones conchylicoles.

Human and animal faecal pollution affects environmental water in inland and coastal areas, with negative implications for recreational uses, public safety and shellfish sanitary status due to the presence of enteric pathogens. Starting from 2011, the revised Bathing Water European Directive (2006/7/CE) requires the establishment of bathing water profiles with an inventory and study of the pollution sources likely to affect water quality. The faecal microbiological indicators used in these regulations, Escherichia coli and enteroccoci, cannot distinguish between human and animal faecal contamination. Thus, alternative methods, that focus on target microorganisms such as bacteria belonging to the Bacteroidales order were developed or are being developed to discriminate between human and animal faecal contamination. The first markers were developed for conventional PCR; however, they were detected in very few environmental waters samples and there were never applied to shellfish. The main objective of this study was to develop and to validate a molecular approach based on quantitative real-time PCR with the Bacteroidales target, in order to identify the origin of faecal contamination in water and shellfish. Phylogenetic analysis of the partial Bacteroidales 16S rRNA gene sequences from human and animal (bovine, pig and wild birds) faeces and effluents allowed the development of 4 host-specific Bacteroidales markers to identify human (Hum-1-Bac), porcine (Pig-1-Bac and Pig-2-Bac) and ruminant (Rum-2-Bac) faecal contaminations. Applied on target and nontarget faeces and effluent samples, these markers were highly sensitive (92.3 - 100%) and specific (93.4 - 100%). The study of the Pig-1-Bac and Pig-2-Bac markers persistence in river water microcosms showed that under unfavourable conditions, aerobic and temperature of 20°C, markers persisted for at least 16 days. These results suggested that the Bacteroidales markers could still be identified after an extended period of time in river waters. This hypothesis was confirmed with their detection and quantification in river waters from the Daoulas catchment estuary and the Elorn estuary (Finistère, Brittany) with concentrations ranging from 2.7 to 6.5 U. Log10 copies/100 ml. Compared with bacterial, viral and chemical markers from runoff and environmental waters, Bacteroidales markers were better to identify the origin of the contaminations.Host-specific Bacteroidales markers were also applied for the first time in shellfish. Selection and optimisation of bacterial DNA extraction protocol from intervalvular liquid of oysters artificially contaminated, allowed detection and quantification of the markers in naturally contaminated oysters. Discrimination of the origin of faecal contamination from samples of water and intervalvular liquid of oysters from 2 different river and estuarine sites, underlined the importance of the human and ruminant faecal contamination more than the porcine contamination. Thus, this study confirms the interest of the host-specific Bacteroidales markers developed from the Bacteroidales target to identify faecal contamination in bathing waters and shellfish harvesting areas.