Analyse moléculaire de la mutagénèse Pour prédire les effets à long tenne de l'exposition aux polluants, la recherche s'oriente sur le développement, la validation et l'application de biomarqueurs de mutagénèse. Les mutations sur les gènes associés au développement tumoral peuvent être détectés dans des stades précoces du cancer, c'est le cas des gènes de la famille Ras et du gène supprésseur de tumeur P53. Les travaux ont porté sur l'étude de l'activation du protooncogène Ras chez les poissons, pour savoir si elle pouvait être corrélée avec l'apparition de tumeurs et à la présence de contaminants cancérigènes. Les exons 1 et 2 du gène Ras de Callionymus lira et de Mullus barbutus ont été amplifiés, clonés et séquencés pour détecter des mutations liées à la présence de micropolluants. La séquence obtenue présente de fortes homologies avec les mêmes gènes de la truite, du goldfish et plus surprenant de l'homme. Une mutation au niveau du codon 1.1 a été observé pour deux poissons présentant des foyers d'hyperplasie. Ce résultat devra être confirmé sur un plus grand nombre de poissons présentant des hyperplasies, des stades plus avancés du développement tumoral et des carcinomes. L'acéthylcholinestérase et son inhibition par les organophospborés et les carbamates: L'acétylcholinestérase est la cible directe des organophosphorés et des carbamates et l'inhibition enzymatique provoquée par ces composés est utilisée en monitoring principalement sur les poissons. Parmis les mollusques, l'huître est un bioindicateur très interéssant qui présente malheureusement une faible sensibilité. Le polymorphisme de l'acétylcholinestérase a été étudié chez ce mollusque et deux formes qui diffèrent par leur structure moléculaire et leur comportement cinétique vis à vis de différents inhibiteurs ont été identifiées dans le muscle adducteur. Ces deux isofonnes ont été purifiés puis séparés en présence de tensio-actifs et leur caractérisation moléculaire a été entreprise. La forme majoritaire représente 70 à 80 % de l'ensemble de l'activité cholinestérasique. C'est un dimère amphiphile membranaire par opposition aux 20 à 30 % restant constitués par un tétramère soluble. La fraction amphiphile présente une sensibilité supérieure à celle de la fraction soluble , de l'ordre de 40000 fois et 15000 fois respectivement pour le Paraoxon et le Carbofuran. Elle se situe en matière de sensibilité au niveau des cholinestérases d'insectes. Le deuxième objectif de cette étude était d'obtenir une enzyme hypersensible utilisable dans des biocapteurs. Les travaux ont permis de fabriquer par mutagénèse dirigée des cholinestérases de drosophyle hypersensibles, en se basant sur les modifications observées entre des populations résistantes et sensibles aux carbamates et aux organophosphorés. Ainsi une acétylcholinestérase mutée en position 199, où l'isoleucine est remplacée par un tryptophane présente une sensibilité 10 fois supérieure vis à vis du Malaoxon. Résistance multidrogue membranaire Certaines cellules de mammifères expriment une glycoprotéine membranaire expulsant activement hors des cellules un large spectre de composés cytotoxiques. Ce système de résistance, appellé pompe MXR, a été étudié chez des organismes marins dans l'objectif de développer un bioindicateur utilisable pour l'évaluation de la qualité du milieu littoral. Les cellules résistantes qui expriment la protéine membranaire peuvent transporter des substrats fluorescents dont la rhodamine. L'activité de transport de cellules de branchies de moules et d'algues unicellulaires (Prorocentrum micans) a été étudiée en se basant sur les modulations des cinétiques de pénétration et d'efflux de la rhodamine B engendrées par différents composés chimiques ( vérapamil, quinidine, doxorubine, tamoxofen .... ), en utilisant la technique des microplaques. Ces travaux ont permis de mettre en évidence et de caractériser ce type de protéine de résistance. Prorocentrum micans constitue le modèle le plus sensible et pourrait devenir un modèle de référence permettant d'obtenir des populations cellulaires résistantes. L'utilisation du test d'efflux de la rhodamine B à également permis de mettre en evidence l'effet inhibiteur de l'Atrazine et de la Simazine à des concentrations de 10 ng!l vis à vis du transport membranaire.