Une nouvelle méthode d’extraction par SPE pour l’identification et la quantification des dinophysistoxines (DTXs) utilisant la Chromatographie Liquide Haute Performance couplée à la Spectrométrie de Masse à piégeage d’ions via une interface d’électro-nébulisation – ou électrospray - (CLHP/ESI/SM2) a été développée. La mise au point et la validation de cette méthode font l’objet du présent mémoire. Les paramètres de la source ESI et de l’analyseur à piège d’ions ont été optimisés pour fournir une détection des DTXs avec un maximum de sensibilité. Ces améliorations ont été effectuées après une séparation en phase inverse sur une colonne C18 avec une première élution sans diviseur de débit en mode isocratique d’acétonitrile/eau à 0,1 % TFA (75 :25, v/v) à 200 Jl/min pendant 15 min. Une deuxième étape d’élution en mode gradient a ensuite été ajoutée, elle permet un traitement optimisé de longues séries d’analyses, sans qu’il en résulte un encombrement du signal. La validation de cette nouvelle méthode (spécificité, seuil de détection et de quantification, linéarité, exactitude) a été faite sur deux matrices différentes : des glandes digestives de moules analysées après une procédure classique d’extraction liquide/liquide et du phytoplancton naturel analysé après extraction en phase solide sur des cartouches de silice. Cette nouvelle méthode permet de passer d’un seuil de quantification de 0,5 ng injecté (détection classique en spectrofluorescence par CLHP (CLHP/F)) à un seuil de 0,05 ng soit 0,011Jg d’acide okadaïque (AO) par gramme de glandes digestives de moule. De même, une quantité d’AO de 2 pg.cellule-1 a pu être détectée, pour un extrait brut phytoplanctonique de 50 cellules/litre de Dinophysis sp . Cette approche qui associe les techniques de la chromatographie liquide (LC) avec les techniques de piégeage en mode SM/SM permet par ailleurs de détecter des traces de toxines minoritaires dont l’abondance augmente lors du vieillissement de la DTX1, contrairement à ce qui est observé avec l’AO. Les spectres en mode SM/SM mettent en évidence les pertes d’H2O consécutives selon des tendances identiques à celles observées lors de la détection de la DTX1 non vieillie. Cela permet d’envisager que ces composées à l’état de traces puissent être des isomères de la DTX1.

A new extraction method (SPE) for detection and quantification of dinophysistoxins (DTXs) using highperformance liquid chromatography coupled to mass spectrometry with an ion trap and electrospray interface (HPLC/ESI/MS2) was elaborated. This report presents development and validation of this method. Parameters of the ESI source and ion trap spectrum analyser were optimized providing detection of DTXs with high sensitivity. These improvements were obtained after reverse-phase separation on a C18 column, with a first elution to 0.1% TFA (75:25, v/v) in isocratic acetonitrile /water mode without flow split with a column flow rate of 200 Jl/min for 15 min. A second elution gradient step was added allowing an optimised processing of long series of analyses without signal obstruction. Validation of this new method (specificity, detection and quantitation limits, linearity, accuracy) was performed on two distinct matrices: mussel digestive glands analysed after a classical liquid/liquid extraction procedure and natural phytoplankton analysed after extraction in solid phase on silica cartridges. This new method reduced quantification limits from 0.5 ng (using classical spectrofluorescence detection with HPLC (HPLC/F)) to 0.05 ng injected, i.e. allowing detection of 0.011 Jg okadaic acid (OA) per gram of crude mussel digestive gland extract. As well, 2 pg.cell-1 OA can be detected for a crude phytoplankton extract of Dinophysis spp with 50 cells/litre,. Combination of HPLC techniques and Paul ion trap mass spectrometer evidences toxin traces analogs to DTX1. Their abundance increases during DTX1 ageing, unlike observations performed on AO toxin. It is noteworthy that observed consecutive losses of H2O from the protonated toxin present a fingerprint similar to that observed during non-ageing DTX1 analyses suggesting that they could be isomer of DTX1.