Aujourd'hui, la méthode la plus utilisée pour l'analyse des échantillons dans le cadre du REPHY est celle de la microscopie. Cependant, cette méthode souffre de nombreux inconvénients : niveaux de compétence différents selon les opérateurs, taxons pouvant faire l'objet d'identifications erronées, observateur sujet à la fatigue et à la déconcentration, erreurs non quantifiables. C'est pourquoi, différents axes d'évolution ont été proposés pour adapter le FlowCAM couplé à ZooPhytoImage aux exigences du REPHY qui sont la justesse et la répétabilité de la mesure. L'objectif de ces nouveaux outils est d'offrir un gain de temps tangible aux observateurs REPHY par rapport aux observations au microscope optique. Le temps d'analyse étant un point clef de ce système, des études ont été menées afin de pouvoir réaliser une acquisition rapide. En ce sens, afin que la mesure soit représentative du milieu, au moins 2000 particules doivent être comptées. Pour réduire le temps d'analyse, nous choisissons donc de pré-concentrer les échantillons lorsque la concentration cellulaire est inférieure à 105 cellules/L. Parallèlement à cela, la répétabilité et la justesse de la mesure sont conditionnées par les réglages optiques du système. C'est pourquoi, un actionneur automatique permettant d’améliorer la répétabilité du positionnement de la cellule de flux par rapport à l'objectif a été développé et installé sur le FlowCAM. Pour effectuer des analyses quantitatives des échantillons, il est également nécessaire de procéder à différents réglages liés au système fluidique du FlowCAM. Des expérimentations sur le sens du débit et sur la viscosité des échantillons ont été réalisées. Il en résulte qu'une pré-filtration systématique des échantillons s'impose pour certaines analyses. Cependant, une pré-filtration de l'échantillon ne permet pas (ou plus) l'analyse de flores totales. Cette solution est donc dépendante des objectifs fixés par l'utilisateur (flores partielles, flores indicatrices, etc.) et doit être appliquée au cas par cas. Les comparaisons quantitatives des abondances et concentrations obtenues par lectures au microscope et par FlowCAM/ZooPhytoImage ont ensuite été réalisées pour des échantillons REPHY 2013. Un volume de 10 mL a été numérisé pour chacun de ces échantillons, ce qui offre une précision de comptage comparable à celle résultant d’un comptage manuel. En effet, une particule détectée par le FlowCAM correspond à une concentration cellulaire in situ de 100 cellules/L, ce qui est équivalent à un comptage au microscope inversé. Les moyennes des taux de reconnaissance des espèces sont d'environ 69% pour les échantillons lugolés et 67.50% pour les échantillons vivants. Ces indices de performances sont donc encourageants. Cependant, de tels scores sont trop faibles pour donner des classifications fiables en routine. Il faut donc valider les données, grâce à une étape de vérification manuelle des classements effectués par l'ordinateur. Cette opération est accélérée par le fait que l'ordinateur a effectué un classement correct à 65-75%, par rapport à une classification purement manuelle des vignettes. Le module de correction détermine une probabilité d'être suspect pour chaque particule, et seules les particules les plus suspectes sont à valider. Cette approche particulière offre un compromis idéal entre la méthode automatique et la validation manuelle totale, tout en garantissant des performances de reconnaissance similaires ou meilleures dans un laps de temps acceptable. Un problème important concerne le stockage et la bancarisation des données issues du système FlowCAM/ZooPhytoImage. En effet, la gestion des données numériques associées à une image ainsi que le problème de la flexibilité du système avec plusieurs protocoles pour un jeu de données, peuvent rendre a priori complexe la bancarisation des données. L'intégration des données sous Quadrige² passe donc par la rédaction d'un cahier des charges afin de définir les exigences du système. Le système couplé FlowCAM / ZooPhytoImage devient un outil véritablement opérationnel en 2014. Totalement adapté aux observations du phytoplancton réalisées dans le cadre du réseau d’observation REPHY, il permettra de mieux répondre aux sollicitations présentes et futures concernant l'évaluation de la qualité des eaux littorales et marines dans le cadre des exigences européennes, telles que la DCE et la DCSMM. Un des bénéfices immédiats sera par exemple pour l’acquisition des données nécessaires au calcul de l’indice abondance composant l’indicateur phytoplancton pour la DCE en Manche- Atlantique, indice qui est basé sur la proportion de taxons du micro-phytoplancton présents en quantité importante dans un échantillon.

Today, the most widely used method for the analysis of samples within the REPHY network, is the microscopy. However, this method has several drawbacks: different skill level depending on the analyst, taxa may be misidentified, analyst subject to fatigue and loss of concentration, non-quantifiable errors. That is why different axis of development have been proposed to adapt the FlowCAM and ZooPhytoImage to the requirements of REPHY network which are the accuracy and repeatability of the measurement. The purpose of these new tools being to provide a tangible gain of time for analysts compared to the observations with optical microscope. The analysis time being a key point of this system, studies were conducted in order to achieve a fast acquisition. To have a representative measurement of the environment, 2,000 particles must be counted. To reduce the analysis time, we choose to pre-concentrate the samples when the cell concentration is less than 105 cells/L. At the same time as this, the repeatability and accuracy of measurement are determined by the optical system settings. This is why, an automatic actuator allowing to improve the repeatability of the flow cell positioning with respect to the lens, has been installed on the FlowCAM. To perform quantitative analyzes of the samples, it is also necessary to make various settings associated to the fluid system of FlowCAM. Experiments on the flow direction and on the viscosity of the samples were performed. The results show that a systematic pre-filtration of the samples is required for some analyzes. However, a pre-filtration of the sample does not allow analysis of total flora. This solution is therefore dependent on the objectives set by the user (partial flora, indicator flora, etc.) and must be applied on a case by case basis. The quantitative comparisons of abundances and concentrations obtained by the microscope and by FlowCAM/ZooPhytoImage were then performed for samples of REPHY 2013. A volume of 10 mL was digitized for each of these samples, which offers a counting accuracy comparable to the one resulting from manual counting. Indeed, one particle detected by FlowCAM corresponds to in situ cell concentration of 100 cells/L, which is equivalent to a count with the inverted microscope. The averages of species recognition rates are approximately 69% for the samples fixed with lugol's solution and 67.50% for the live samples. These performance indices are encouraging. However, such scores are too low to provide reliable classifications routinely. It is therefore necessary to validate the data through a manual verification step of predictions done by the computer. This process is accelerated by the fact that the computer has made a correct classification of 65-75 %, with respect to a manual classification of thumbnails. This module determines a probability of being suspect for each particle, and only the most suspect particles are validated. This particular approach offers an ideal compromise between the automatic method and the total manual validation, while guaranteeing similar or better performance of recognition within an acceptable time. An important problem lies in the storage and banking of data from the FlowCAM/ZooPhytoImage system. Indeed, the management of digital data associated with an image and the problem of the flexibility of the system with multiple protocols for a dataset, can be complex. Therefore, the integration of data in Quadrige ² requires the writing of specifications to define system requirements. The FlowCAM / ZooPhytoImage is becoming an operational tool in 2014. Completely adapted to the phytoplankton observations performed in the context of the French monitoring network REPHY, it will allow answering more accurately to the questions of WFD and MSFD concerning the evaluation of marine water quality. For instance, the first benefit will be for the acquisition of data necessary to the calculation of abundance index, part of the phytoplankton index for WFD in Channel and Atlantic water bodies : as a matter of fact, this index is based on the proportion of micro-phytoplankton taxa which are very abundant in a water sample.